Instituto Brasileiro do PVC

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Validação de metodologias para a liberação de DINP - CSTEE – 2001

O Instituto do PVC apresenta a tradução do parecer técnico sobre o relatório "Validação de metodologias para a liberação de DINP – di-iso-nonil-ftalato – de brinquedos em saliva artificial" (2001 EUR 19826 EN) Expresso na 25a reunião plenária do CSTEE – Comitê Científico Sobre Toxicidade Ecotoxicidade e Meio Ambiente, em Bruxelas em 20 de julho de 2001



Introdução


Este documento foi enviado pela COMISSÃO EUROPÉIA, DIRETORIA GERAL PROTEÇÃO À SAÚDE E AO CONSUMIDOR, Diretoria C – Pareceres Científicos, Unidade C2 – Administração de Comitês Científicos, Cooperação Científica e Redes, Comitê Científico sobre Toxicidade, Ecotoxicidade e Meio Ambiente (CSTEE).


C2/JCD/CSTEE op método(s) de teste liberação DINP/20072001/D(01) COMITÊ CIENTÍFICO SOBRE TOXICIDADE, ECOTOXICIDADE E MEIO AMBIENTE (CSTEE) Parecer sobre o relatório: "Validação de metodologias para a liberação de DINP – di-iso-nonil-ftalato de brinquedos em saliva artificial (2001 EUR 19826 EN)", expresso na 25a reunião plenária do CSTEE em Bruxelas, 20 de julho de 2001.



Histórico


À luz de opiniões prévias do CSTEE com relação a métodos de teste referentes à migração de ftalato contido em brinquedos flexíveis de PVC e em artigos para cuidados infantis e, em particular, referente da opinião de 5 de Setembro de 2000 com relação a um programa de validação de métodos de teste para a migração de ftalatos, o JRC - Joint Research Centre - desenvolveu e coordenou um programa para a validação de metodologias para medir a liberação de DINP oriundo de brinquedos em saliva artificial.


Termos de referência


O Comitê, com base na análise do seguinte relatório: "Validação das metodologias para a liberação de di-iso-nonil-ftalato (DINP) de brinquedos em saliva artificial", DG JRC - Joint Research Centre - da Comissão Européia, 2001 EUR 19.826 EN, deverá responder as seguintes perguntas:


1 - O programa para a validação dos métodos de teste como executado pelo JRC apresenta boa qualidade científica?


2 - O método head over heels que está sendo considerado para ser validado pelo JRC é adequado para verificar a compatibilidade dos brinquedos flexíveis de PVC e dos artigos de cuidado infantil que contêm ftalatos com os limites de migração definidos pelo CSTEE para os ftalatos?


Na avaliação da validade do método, o CSTEE também deverá levar em consideração as diferenças de exposição das crianças aos ftalatos, que poderiam resultar de diferenças nos usos pretendidos das várias categorias de brinquedos flexíveis de PVC e artigos de cuidado infantil.


As respostas do CSTEE


1 - O programa para a validação de métodos para medir os índices de migração do DINP dos artigos de PVC para saliva artificial foi de modo geral realizado com boa qualidade científica. No entanto, o "feedback" dos laboratórios participantes deveria ter sido incluído neste relatório. Esta falha deve-se provavelmente às limitações de tempo, entretanto o CSTEE espera que os comentários dos laboratórios sejam levados em consideração na continuação dos trabalhos. Outros comentários adicionais com referência ao relatório estão incluídos na seção "Comentários Detalhados".


2 - O método head over heals produz resultados e apresenta boa repetitibilidade (dentro da variação de laboratório) e reprodutibilidade aceitável (entre variação de laboratório), e os resultados são comparáveis com as médias dos resultados obtidos em estudos in vivo anteriores. O valor de orientação (6,7 µg/10cm2/min) recomendado pelo CSTEE foi estabelecido para proteger o indivíduo com a maior exposição. No entanto, este valor é mais alto que os resultados obtidos com o método head over heal. Pode ser possível superar esta diferença através da utilização de um fator.


Os resultados de migração obtidos com estes métodos in vitro são independentes do uso pretendido dos itens analisados.



Comentários detalhados


Para simular a migração de ftalatos, quando bebês e crianças pequenas chupam/mastigam brinquedos flexíveis de PVC, TNO, Holanda e LGC, Reino Unido propôs 3 métodos in vitro para a migração dinâmica de DINPcontido em brinquedos de PVC:



Uma comparação entre os laboratórios referente à determinação da migração de DINP de brinquedos de PVC que visa validar os métodos in vitro acima mencionados, é descrita no relatório apresentado para o CSTEE (DG JRC Comissão Européia, 2001 EUR 19.826 EN).


O exercício de validação foi organizado e realizado de acordo com a diretriz ISO 57253 e protocolo harmonizado IUPAC4, conforme recomendação do CSTEE5. O DINP foi escolhido como agente plastificante modelo para o estudo. Quinze laboratórios da União Européia e dos Estados Unidos participaram do exercício de validação no qual a migração do DINP de um material de PVC de referência e de 5 brinquedos de PVC foi determinada. O PVC de referência e os brinquedos com formulação e processo de fabricação conhecidos foram preparados especialmente para o estudo de validação. O CSTEE teria preferido ver as formulações e o processo de fabricação efetivos inseridos no relatório. Estimava-se que a taxa de liberação de DINP de pelo menos uma das amostras de brinquedo seria mais alta que o valor de orientação proposto: > 6.7 µg/10cm2/min. Este brinquedo deveria ser identificado no relatório. Nem todos os laboratórios relataram todos os resultados, mas os comentários dos laboratórios participantes (como limitações de tempo, pane de instrumentos e outros problemas) infelizmente não foram incluídos no relatório.


Todos os 3 métodos baseiam-se no princípio de que o ftalato de uma amostra de brinquedo é liberado na saliva artificial sob condições de agitação mecânica pré-definidas, e que ele é extraído em ciclohexano e determinado por HPLC e/ou GC-MS. O padrão interno escolhido, butilbenzilftalato (BBP) está longe de ser perfeito, especialmente porque ele pode ser utilizado como agente plastificante em PVC. A saliva artificial utilizada no estudo é destituída de qualquer substância orgânica. Apenas resultados aceitáveis (valores de exceção determinados pelo teste de Coachran e Grubb) foram utilizados para a avaliação estatística do desempenho de método através de análise unidirecional da variação (ANOVA).


Um procedimento padrão de abertura (SOP - Standard Operation Procedure) e amostras de teste foram fornecidos para os laboratórios participantes. Para garantir a menor variação possível na análise dos vários laboratórios, o mesmo tipo de colunas de cromatografia, agitadores e outros materiais importantes foram também fornecidos aos participantes.


O procedimento adotado para o teste de homogeneidade do material de referência e das amostras de brinquedos foi adequado. Os resultados de teste de homogeneidade indicaram que todas as amostras foram colhidas de populações homogêneas de materiais de teste no que se refere ao conteúdo de DINP. A recuperação absoluta deve ser possível de determinar, já que o laboratório recebeu o produto DINP utilizado no material. A concentração de DINP no produto utilizado deveria ter sido relatada, bem como a recuperação e sua faixa. O coeficiente de variação (CV) das recuperações dos materiais de teste variou entre 1,7-5,5%, 2,75% para o material de referência.


As recuperações do DINP da saliva artificial fortificada com esta substância (5 µg/ml e 25 µg/ml) foram aceitáveis quando HoH (recuperação 92-94%) e HSM (recuperação 75-94%) foram utilizados. No entanto, a recuperação DINP da saliva artificial foi relativamente baixa (65-84%) quando o método HSS foi utilizado. As recuperações na taxa de liberação alvo de DINP de 9 µg/min (ou próxima da taxa de liberação alvo de DINP) correspondentes ao nível de concentração de 11 µg/ml deveriam ser relatadas (recuperações em 15 µg/ml foram analisadas). A repetitibilidade dos experimentos de recuperação de DINP (agitação mecânica da saliva fortificada + extração em ciclohexano + determinação analítica) nos laboratórios individuais (RSDr) foi 1-5% para todos os 3 métodos. No entanto, a reprodutibilidade entre os laboratórios (CV, RSDR) da recuperação de DINP da saliva fortificada ficou entre 12-16%, 14-43% e 13-41% respectivamente para os métodos HoH, HSM e HSS. Como o desvio padrão relativo da repetitividade para (RSDr) todos os 3 métodos é comparável (faixa 1-5%), a faixa mais ampla de reprodutibilidade pelos métodos HSS e HSM comparada à do HoH pode estar associada às diferenças nos princípios da agitação mecânica utilizada nos 3 métodos.


O desempenho dos métodos sujeitos à validação para a análise de migração do DINP está descrito na tabela 1. O método HoH foi validado com número suficiente de resultados aceitáveis (válidos) (de > de 8 laboratórios) em conformidade com as diretrizes ISO e IUPAC. No entanto, este não foi o caso quando o método de agitação horizontal foi utilizado (resultado de 6-9 laboratórios foram aceitos para várias amostras de brinquedos). Isto significa que os métodos de agitação horizontal não devem ser considerados como validados pelo ensaio em colaboração. No entanto, como os números dos resultados válidos obtido com o emprego dos métodos de agitação horizontal são muito próximos aos recomendados pelo ISO/IUPAC, os desempenhos destes métodos também foram avaliados no presente documento.


A taxa média de liberação de DINP do PVC de referência pelo HoH e HSS foi comparável e também similar à taxa de liberação de DINP do disco de PVC descrito em estudos anteriores1,2,6. No entanto, a taxa média de liberação de DINP do PVC de referência bem como dos brinquedos de PVC no HSM foi no mínimo 3 vezes mais baixa se comparada à taxa de liberação de DINP quando os métodos HoH ou HSS forem utilizados. Portanto, o método HSM não é adequado para a análise in vitro da migração de DINP de brinquedos de PVC, e isto não será mais discutido no presente documento.


A repetitividade (RSDr) da liberação de DINP do PVC de referência bem como dos brinquedos de PVC, medida nos laboratórios individuais, tanto por HoH e HSS foi < 10%, e portanto aceitável. A reprodutibilidade entre os laboratórios do método HoH (RSDR, CV) foi de aproximadamente 30% para a medição da taxa de liberação de DINP do PVC de referência, e de 35-65% quando as amostras de brinquedos foram analisadas. A reprodutibilidade da determinação da taxa de liberação de DINP tanto do PVC de referência como das amostras de brinquedos pelo HSS foi de 64-140%. Assim, embora a média das taxas de liberação de DINP determinada pelos métodos HoH e HSS pareça ser similar (Tabela 1), a faixa dos resultados dos diferentes laboratórios é relativamente ampla quando o método HSS foi empregado (tabela 2A e tabela 2B, anexo 5 do relatório). Isto pode ter uma grande influência sobre o teste de compatibilidade dos brinquedos em relação à liberação de DINP. Por exemplo, todas as amostras de teste podem ser aprovadas (quando a taxa de liberação de DINP para compatibilidade for considerada como 6.7 µg/10 cm2/min) por todos os laboratórios de teste que utilizam HoH como método de teste. No entanto, as amostras de brinquedo "Pato" e "Vagalume" não serão aprovadas por alguns dos laboratórios que utilizam HSS como método de teste (Tabela 2A e Tabela 2B, anexo 5 do relatório).


Portanto, o exercício de validação revelou o seguinte:



Na tabela na página 21, há um erro na unidade para migração específica de área, a unidade correta deveria ser µg/min/10 cm2.



Discussões/Conclusões


Os resultados do exercício de validação indicaram que a liberação de DINP no ato de chupar/mastigar brinquedos de PVC não pode ser simulada in vitro pelo método HSM já que a liberação de DINP observada do PVC de referência bem como dos brinquedos foi muito baixa e a reprodutibilidade do método foi insatisfatória (62-110%). A reprodutibilidade da taxa de liberação de DINP do PVC de referência e dos brinquedos testada pelo método HSS foi de 64-140%. Como resultado, alguns laboratórios que utilizam o método HSS para o teste de brinquedos de PVC podem aprovar um brinquedo enquanto outros não. Portanto, o método HSS também pode não ser adequado como um método padrão para a análise in vitro da liberação de DINP de brinquedos. A reprodutibilidade entre laboratórios (RSDR) da liberação de DINP pelo método HoH para o PVC de referência foi de aproximadamente 30% e de 35-65% para 5 brinquedos diferentes. Assim, a reprodutibilidade do método HoH foi melhor que a dos dois outros métodos investigados no presente exercício de validação, mas ela pode não ser ideal. As implicações da reprodutibilidade máxima permitida de um método de teste padrão sobre a compatibilidade de um produto em relação à liberação foram descritas em um documento anterior do CSTEE7 . Mostrou-se que os resultados de teste com uma reprodutibilidade permitida (RSDR) de 20% (com 1 SD) podem exceder o limite regulatório (em outras palavras TDI) em 50%, mas ele irá passar pelo teste. A permissão de 30% de reprodutibilidade (com 1 SD) resultará em um excesso de TDI de 90%.


Portanto, o método HoH pode ser utilizado apenas como um método padrão se as taxas de liberação determinadas por este método forem corrigidas para as grandes variações entre os laboratórios. Uma razão adicional para a utilização de um fator de correção pode também ser a seguinte:


A taxa de liberação de DINP do PVC de referência pelo método HoH foi mais baixa (5,2 µg/10 cm2/min pior caso pela análise GC-Ms e 6,9 µg/10 cm2/min pior caso pela análise HPLC) que o pior caso de liberação de DINP (8,9 µg/10 cm2/min) observado no estudo in vivo6. Isto pode ser adicionalmente corroborado pelo fato de que a taxa média de liberação de DINP acima do valor de orientação proposto (6,7 µg/10 cm2/min) não foi obtida para nenhum dos brinquedos testados, nem mesmo do brinquedo especialmente fabricado para liberar altas quantidades de DINP.


Os seguintes pontos adicionais também devem ser considerados quando da recomendação do HoH como método padrão para a determinação da liberação de ftalato dos brinquedos de PVC in vitro:



Por último, a versão final do método (SOP) deve incluir as sugestões das experiências feitas pelos laboratórios participantes.



Referências


1 - CSTEE/97/1 - Add 149 [Validation of the method "Determination of Diisononylphthalate in saliva simulant" – TNO report V99.598 from Rinus Rijk & Karl Ehlert (TNO Nutrition and Food Research Institute) – 27 May 1999].


2 - CSTEE/97/1 – Add 148D (Consumer Safety Research Report – LGC Technical Report Number: LGC/1999/DTI/004 – June 1999 "Inter-laboratory Validation of Laboratory-based Agitation Methods for the Determination of Phthalate Plasticiser Migration from PVC Toys and Childcare Articles").


3 - ISO 5725: Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results, Part 1-6, (1994).


4 - Horowitz, W. IUPAC: protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies. Pure & Applied Chemistry 67, 331-343 (1995).


5 - Opinion of the Scientific Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment (CSTEE) on validation of test methods for phthalate migration – Opinion expressed at the 17th CSTEE plenary meeting, Brussels, 5 September 2000.


6 - Report from Dutch Consensus Group: Phthalate release from soft PVC toys. RIVM report 613320 002, RIVM, NL. September 1998.


7 - Addendum to Opinion on TNO, LGC and U.S. CPSC reports on phthalate migration test validation adopted at the 11th CSTEE plenary meeting on the 28th September 1999 adopted at the 12th CSTEE plenary meeting on 25th November 1999.


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